重組腺相關病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV) 載體(tǐ)與其他病毒載體(tǐ)相比, 具備感染能力強、可(kě)持續表達目的基因、無緻病性和(hé)非基因組整合等優點, 已成為(wèi)體(tǐ)內(nèi)基因治療的主要病毒載體(tǐ)。
本文總結了rAAV基因治療産品的最新研究進展, 從原材料、生(shēng)産工藝及質量控制(zhì)等方面對此類産品的藥學評價考慮要點展開(kāi)討(tǎo)論, 以期促進此類産品的臨床轉化與應用。同時(shí)對3個(gè)國外已上(shàng)市産品的藥學評價考慮要點及常見問題進行(xíng)討(tǎo)論。
據不完全統計(jì), 目前至少(shǎo)有(yǒu)238 個(gè)rAAV基因治療産品正在開(kāi)展臨床試驗, 3 個(gè)rAAV基因治療制(zhì)品已在歐美注冊上(shàng)市(表1)。
表1 rAAV基因治療産品的臨床應用
rAAV的載體(tǐ)設計(jì)應基于臨床有(yǒu)效性和(hé)安全性, 一般為(wèi)靶向特定組織或細胞, 删除與毒力、緻病性或複制(zhì)能力相關的基因, 以确保制(zhì)品的安全性。同時(shí), 設計(jì)應考慮載體(tǐ)基因組的大(dà)小(xiǎo)、包裝效率和(hé)表達效率, 并盡可(kě)能減少(shǎo)與體(tǐ)內(nèi)相關病毒的同源性, 以避免形成複制(zhì)型病毒。構建病毒的質粒應考慮抗生(shēng)素抗性基因引入的風險, 一般不得(de)使用氨苄青黴素抗性基因。
目前産業界用于rAAV生(shēng)産的細胞基質既有(yǒu)哺乳動物細胞(HEK293、BHK)、人(rén)腫瘤細胞系(HeLa、A549),也包括昆蟲細胞系(SF9) 等。
包裝細胞應進行(xíng)充分的鑒定并建庫。鑒定項目一般包括鑒别、純度、基因型/表型、成瘤性/緻瘤性、遺傳穩定性和(hé)引入序列等。除常規無菌、真菌和(hé)支原體(tǐ)外, 尤其要關注細胞基質的種屬特異性病毒。如: HEK293 細胞應檢定CMV、HIV-1/2、HILV-1/2、HH-V6/8、JV virus、BK virus、EBV、parvovirusB19、HBV、HPV和(hé)HCV等病毒; SF9 細胞應檢定螺原體(tǐ)、彈狀病毒等昆蟲病毒。
用人(rén)腫瘤細胞系作(zuò)為(wèi)包裝細胞, 還(hái)應充分評估其緻瘤性和(hé)成瘤性的風險, 以及緻瘤病毒的感染情況等, 如: HeLa 細胞為(wèi)來(lái)自人(rén)子宮頸癌組織的腫瘤細胞, 已知含有(yǒu)50 個(gè)拷貝數(shù)的HP
最早的rAAV 生(shēng)産工藝采用質粒、輔助病毒感染包裝細胞生(shēng)産。目前采用較多(duō)的是三質粒共轉染HEK 293 生(shēng)産工藝, HEK293 細胞中含有(yǒu)腺病毒(adenovirus, AdV) 的E1a 和(hé)E1b 基因, 共轉染轉移質粒(含目的基因和(hé)ITR序列)、結構質粒(含rep/cap 基因) 和(hé)輔助質粒( 複制(zhì)病毒基因E2A, E4,VARNA 等), 48～72 h 後即可(kě)重組包裝rAAV。
該方法适用于多(duō)種血清型rAAV, 發酵産率一般可(kě)達每毫升1014 V.G. (vector genome), 一般可(kě)滿足早期臨床試驗rAAV用量(<1015 V.G.)。但(dàn)是, 受貼壁培養方式所限, 多(duō)質粒瞬轉工藝較難滿足商業化生(shēng)産需求(>1016 V.G.)。
構建含有(yǒu)輔助基因rep/cap和(hé)目的基因的穩轉HeLa 細胞系, 經腺病毒感染後也可(kě)包裝出rAAV 病毒。尤其是采用可(kě)懸浮培養的HeLa S3細胞系, 穩轉細胞生(shēng)産法可(kě)直接放大(dà)至2 000 L規模。與之類似, 構建含有(yǒu)ICP27 基因的BHK 細胞,經轉染含有(yǒu)輔助基因和(hé)目的基因的複制(zhì)缺陷型d27.1HSV後, 也可(kě)高(gāo)效表達rAAV。
但(dàn)是, 穩轉細胞法的主要缺點在于, 細胞構建和(hé)遺傳穩定性研究較為(wèi)耗時(shí),且生(shēng)産過程中使用輔助病毒存在病毒安全性風險。
杆狀病毒具有(yǒu)高(gāo)度的種屬特異性, 不感染脊椎動物, 能将rAAV基因和(hé)輔助功能的反式作(zuò)用元件轉移至SF9 昆蟲細胞中。因此, 近年也開(kāi)始應用于rAAV 的大(dà)規模生(shēng)産。該方法的優勢在于杆狀病毒生(shēng)物安全性好, 感染效率高(gāo), 生(shēng)産工藝便于放大(dà)。但(dàn)質量控制(zhì)項目中也應考慮杆狀病毒及DNA相關物質殘留。
藥學評價要點： 對于rAAV 上(shàng)遊生(shēng)産工藝, 藥學評價建議關注關鍵工藝的工藝開(kāi)發與驗證, 如采用多(duō)質粒瞬時(shí)轉染或加入輔助病毒等工序中, 應通(tōng)過工藝開(kāi)發與驗證說明(míng)關鍵工藝參數(shù)的控制(zhì)範圍及中間(jiān)體(tǐ)驗收标準, 如不同載體(tǐ)配比、轉染試劑用量、輔助病毒與生(shēng)産細胞的感染複數(shù)等。
rAAV 純化工藝一般包括細胞培養液收獲、化學法/物理(lǐ)法裂解細胞、benzonase 酶消化去除核酸物質、多(duō)步層析和(hé)密度梯度離心、置換制(zhì)劑處方緩沖液等工序, 其中, 親和(hé)層析模拟細胞受體(tǐ)的結合作(zuò)用捕獲rAAV。如: 硫酸肝素填料可(kě)特異性結合rAAV2, AVB瓊脂糖填料可(kě)結合1、2、3、5 和(hé)8 等多(duō)種血清型rAVV[22]。對于空(kōng)載體(tǐ)的去除, 目前多(duō)采用碘克沙醇和(hé)氯化铯超速離心法。
值得(de)關注的是, 中國藥典相關總論中明(míng)确指出,“除另有(yǒu)證明(míng)其合理(lǐ)性外, 不得(de)使用氯化铯-溴化乙錠密度離心法進行(xíng)基因治療産品的純化”。
如上(shàng)所述, 采用杆狀病毒-昆蟲細胞或穩轉細胞系(HeLa) 生(shēng)産工藝時(shí)會(huì)使用杆狀病毒或輔助病毒(HSV、Ad5 等)。因此, 下遊工藝應增加特定病毒去除/滅活工序。
如: 采用表面活性劑TritonX-100 (0.5%, v/v) 和(hé)增加病毒過濾工序去除收獲液中殘留杆狀病毒; 采用加入表面活性劑、低(dī)pH值滅活等工序去除HSV病毒; 采用離子交換法、短(duǎn)時(shí)間(jiān)加熱(52 ℃、10 min) 和(hé)納濾等工序去除腺病毒等。
由于rAAV衣殼蛋白對溫度和(hé)pH值變化并不敏感, rAAV 制(zhì)品的制(zhì)劑處方開(kāi)發相對簡單。通(tōng)常慣用在鹽溶液中加入200 mmol·L-1硫酸鎂或0.001%泊洛沙姆F68 避免産生(shēng)聚體(tǐ), 基本可(kě)支持長期保存(-65 ℃) 和(hé)運輸穩定性。
對于rAAV 下遊生(shēng)産工藝, 藥學評價建議結合産品相關雜質、過程相關雜質的去除效率評估純化工藝合理(lǐ)性與穩健性。對于使用輔助病毒的生(shēng)産工藝應結合收獲液中病毒含量, 進行(xíng)病毒去除/滅活工藝驗證,綜合評估病毒的殘留安全性。
rAAV 制(zhì)品的工藝相關雜質包括病毒包裝與純化工藝中引入的宿主蛋白、宿主DNA、輔助病毒、質粒、血清和(hé)氯化铯等組分。由于病毒包裝細胞通(tōng)常含有(yǒu)緻癌基因, 如HEK293 細胞內(nèi)含有(yǒu)E1A 的腺病毒基因, HeLa 細胞內(nèi)的E6、E7 緻癌基因。因此, 一般對于宿主細胞殘留DNA 含量應小(xiǎo)于10 ng/Dose, 且殘留DNA片段應小(xiǎo)于200 bp。
rAAV 制(zhì)品的相關雜質包括未包裝基因的空(kōng)病毒、包裝錯誤基因(宿主DNA、不完整目的基因、輔助病毒基因等) 的病毒、無感染活性的病毒顆粒、聚體(tǐ)或氧化形式的病毒顆粒等。
這些(xiē)産品相關雜質不僅不能實現目的基因在靶細胞的表達, 還(hái)可(kě)在臨床上(shàng)引起免疫原性或基因毒性。如: 多(duō)質粒順轉體(tǐ)系中, 一般空(kōng)病毒占比可(kě)以達到50%～98%。空(kōng)病毒不具感染能力, 且容易形成病毒聚體(tǐ)和(hé)降解, 引起體(tǐ)內(nèi)免疫反應。因此, 質量研究中應采用A260/A280、透射電(diàn)鏡、分析性離心和(hé)質譜等技(jì)術(shù)檢測空(kōng)病毒含量。
複制(zhì)型腺相關病毒(replication-competent AAV,rcAAV) 是由于同源/非同源重組發生(shēng)後, rAAV病毒同時(shí)包裝rep 和(hé)cap/AAP等基因所産生(shēng)的産品相關雜質。 rcAAV在輔助病毒存在的條件下可(kě)以進行(xíng)複制(zhì)擴增。rcAAV的檢測一般采用在輔助病毒存在下使用敏感細胞進行(xíng)擴增, 細胞裂解液經過多(duō)次擴增傳代後, 采用Southern blot 和(hé)qPCR法測定rep 或cap 基因。如: 已進入臨床試驗的rAAV 制(zhì)品scAAV2/8-LP1-hFIXco 采用qPCR 法控制(zhì)rcAAV 含量限度低(dī)于1/2.25×106 。目前也有(yǒu)報道(dào)稱采用優化後的多(duō)質粒瞬轉工藝,rcAAV含量限度可(kě)低(dī)于1/108 V.G.。
rAAV病毒生(shēng)産質量控制(zhì)包括過程控制(zhì)與終産品放行(xíng)檢測(表2)。
如: 病毒包裝用質粒應進行(xíng)鑒别、含量、純度、宿主細胞DNA殘留、轉染效率、細菌內(nèi)毒素、無菌等質量控制(zhì);
病毒收獲液應控制(zhì)外源因子(無菌、支原體(tǐ)等)、外源病毒、目的病毒等檢測;
rAAV原液與制(zhì)劑放行(xíng)項目一般包括外觀、理(lǐ)化性質(pH值、滲透壓)、病毒滴度(物理(lǐ)滴度、感染滴度)、純度(蛋白純度、吸光度比值、宿主DNA殘留、質粒DNA殘留、核酸酶殘留)、效力(目的基因表達、體(tǐ)外活性、體(tǐ)內(nèi)活性)、安全性 (內(nèi)毒素、無菌、rcAAV)。
此外, 對于眼部用藥的rAAV 制(zhì)劑, 內(nèi)毒素含量應不高(gāo)于2.0 EU/dose/eye 或0.5 EU/mL, 應按照眼用制(zhì)劑控制(zhì)不溶性微粒(USP<789>)、産品的放行(xíng)檢測應包括配置後産品等。
對于rAAV 制(zhì)品的效力測定方法, 應體(tǐ)現其病毒物理(lǐ)滴度、感染活性及生(shēng)物活性。
一般在臨床試驗早期可(kě)采用qPCR 法測定病毒基因組, 敏感細胞或靶向細胞測定其感染能力和(hé)目标産物表達能力表征産品效力。
關鍵性臨床試驗開(kāi)展後應進一步開(kāi)發反映産品作(zuò)用機制(zhì)的體(tǐ)外酶活法或體(tǐ)內(nèi)功能實驗法。如:SPK-RP65 在進入Ⅲ期臨床後, 通(tōng)過轉染指示細胞(HEK293-LRAT) 後測定RPE65 蛋白酶促反應産物視(shì)黃醇含量來(lái)計(jì)算(suàn)産品效力。
值得(de)指出的是, 對于qPCR法測定病毒基因組應采用線性DNA繪制(zhì)标準曲線, 若采用超螺旋DNA作(zuò)為(wèi)參照品, 載體(tǐ)基因組含量測定值顯著高(gāo)于真實值。
目前, 國際上(shàng)僅有(yǒu)3個(gè)rAAV基因治療産品(glybera、luxturna 和(hé)zolgensma) 獲批上(shàng)市, 國內(nèi)此類産品多(duō)處于研發早期階段, 工業界與監管方對于rAAV 基因治療産品的藥學研究與評價均缺乏實踐經驗。下文拟結合國外已上(shàng)市産品審評報告中披露信息, 對此類産品的藥學評價考慮要點及常見問題進行(xíng)討(tǎo)論。
Glybera (alipogene tiparvovec, AAV1-LPLS447X)是Amsterdam Molecular Therapeutics 公司開(kāi)發的攜帶人(rén)LPLS447X 基因的rAAV2 型基因治療産品, 臨床上(shàng)肌肉注射用于治療成人(rén)脂蛋白脂肪酶缺陷症。
本品工藝開(kāi)發過程中存在重大(dà)工藝變更: 第一代生(shēng)産工藝(AMT-010) 采用HEK293 表達系統, 商業化生(shēng)産工藝(ATM-011) 則采用杆狀病毒-昆蟲細胞系統表達, 因此開(kāi)展了藥學和(hé)非臨床可(kě)比性研究。
下遊工藝中采用工藝規模縮小(xiǎo)模型對包膜病毒、非包膜病毒去除能力進行(xíng)了工藝驗證。
質量研究對 3 批連續生(shēng)産批次制(zhì)品進行(xíng)了充分的表征研究, 其中包括: 組分(基因組完整性/大(dà)小(xiǎo)、蛋白質分析、分子質量、衣殼蛋白); 物理(lǐ)性質(顆粒大(dà)小(xiǎo)、病毒顆粒糖基化修飾); 一級結構(序列确證、蛋白鑒定); 高(gāo)級結構(透鏡電(diàn)鏡、分析超速離心); 生(shēng)物活性(感染性顆粒、比活、效力) 等。
EMEA審評認為(wèi), 由于細胞收獲液中含有(yǒu)大(dà)量感染性杆狀病毒, 且下遊工藝不能提供足夠的病毒去除效果, 要求申請(qǐng)人(rén)補充提供臨床注射杆狀病毒殘留DNA的風險分析報告, 并建議産品放行(xíng)檢測項目中增加感染性杆狀病毒殘留和(hé)rcAVV等檢查項目。
并且, EMEA審評建議産品上(shàng)市後生(shēng)産工藝應進一步增加杆狀病毒去除工序(如病毒過濾), 後期應提高(gāo)雜質(包裝細胞DNA、殘留Rep/Cap 基因、rcAAV、感染性杆狀病毒等殘留) 檢測方法靈敏度。
Luxturna (voretigene neparvovec-rzyl, SPK-RPE65)系美國Spark Therapeutics 公司研發的攜帶人(rén)RPE65基因rAAV-2 型基因治療制(zhì)品, 臨床上(shàng)視(shì)網膜下注射用于治療先天性黑(hēi)朦症。
産品采用三質粒共轉染貼壁HEK293 細胞, 滾瓶生(shēng)産工藝。生(shēng)産工序包括: 細胞擴增、轉染、培養基置換、收獲培養液、切向流過濾、均質、離子交換色譜、密度梯度離心、制(zhì)劑緩沖液置換和(hé)過濾等;
本品Ⅲ期臨床試驗前曾發生(shēng)場(chǎng)地、包裝容器(qì)等工藝變更, 采用“Side-by-side”法對産品質量的方法進行(xíng)産品可(kě)比性研究。
産品放行(xíng)檢測項目包括: 理(lǐ)化(外觀、pH值、濃度、可(kě)抽取體(tǐ)積)、鑒定(目的基因)、含量(基因組濃度)、效力(目的基因表達、體(tǐ)外活性)、純度和(hé)安全性項目(內(nèi)毒素、顆粒物、無菌) 等, 質量研究中對宿主DNA、質粒DNA、E1A 基因和(hé)牛血清蛋白等工藝相關雜質殘留進行(xíng)控制(zhì)。
FDA審評認為(wèi), 本品上(shàng)市後應繼續完成包裝細胞HKE293 穩定性及産品實時(shí)穩定性等研究。
Zolgensma (onasemnogene abeparvovec, AVXS-101)系AveXis 公司開(kāi)發的攜帶運動神經元蛋白1 (survival motor neuron, SMN) 基因的rAAV9 型基因治療産品,臨床上(shàng)靜脈注射治療兒童脊髓肌肉萎縮症。
本品在工藝開(kāi)發過程中, 結合目标質量屬性采用風險評估方法确定本品關鍵質量屬性, 采用工藝規模縮小(xiǎo)模型确定工藝設計(jì)空(kōng)間(jiān)并進行(xíng)工藝驗證;
本品在關鍵性臨床試驗開(kāi)展前、注冊上(shàng)市前, 先後發生(shēng)場(chǎng)地、工藝和(hé)制(zhì)劑處方等變更。
FDA 審評判定工藝變更前後産品純度和(hé)VG 單位效力保持一緻; 本品的“效力”檢測項中既包括定量檢測靶細胞SMN蛋白表達水(shuǐ)平, 也包括體(tǐ)內(nèi)半定量法檢測小(xiǎo)鼠“生(shēng)存率”。
值得(de)關注的是, 由于本品在І 期臨床試驗開(kāi)展過程中“含量”分析方法缺乏精确度與準确度, 44 個(gè)月後采用更新的方法重新修正臨床給藥劑量。此外, 在本品穩定性實驗中, 觀測到“含量”和(hé)“效力”有(yǒu)所下降。
轉自：藥學學報 商圖藥訊
