幹細胞的出現極大(dà)地推動了再生(shēng)醫(yī)學的發展，涵蓋了基于細胞的高(gāo)通(tōng)量藥物篩選、細胞移植和(hé)器(qì)官移植等應用領域，展現了廣闊的應用前景。幹細胞行(xíng)業，尤其是間(jiān)充質幹細胞治療的快速發展，方興未艾。
随着對間(jiān)充質幹細胞治療機理(lǐ)的深入研究，研究發現間(jiān)充質幹細胞通(tōng)過外泌體(tǐ)來(lái)發揮治療作(zuò)用，從而推動了幹細胞外泌體(tǐ)的研究和(hé)發展。
2013年，諾貝爾生(shēng)理(lǐ)學或醫(yī)學獎授予了三位科學家(jiā)，表彰其在細胞間(jiān)囊泡運輸調控機制(zhì)領域作(zuò)出的突出貢獻。諾獎的肯定，使得(de)胞外囊泡及其生(shēng)理(lǐ)學功能成為(wèi)熱點，得(de)到廣泛研究。
不同類型的細胞均可(kě)通(tōng)過出芽方式釋放各種各樣的囊泡（如外泌體(tǐ)、微囊泡、凋亡小(xiǎo)體(tǐ)）到細胞外，囊泡大(dà)小(xiǎo)從40nm到毫米不等，統稱為(wèi)胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EV）。
EV的外層為(wèi)磷脂膜，內(nèi)層由特定類型的蛋白質組成，包括酶、生(shēng)長因子、受體(tǐ)、細胞因子、脂質、RNA和(hé)代謝物。直徑30～150nm的胞外囊泡，即為(wèi)外泌體(tǐ)（exosome）。
早在20世紀60年代，EV的生(shēng)理(lǐ)特性得(de)到闡述，EV可(kě)在細胞、器(qì)官之間(jiān)，甚至有(yǒu)機體(tǐ)之間(jiān)傳遞信息，在血液、尿液、腦(nǎo)脊液、母乳和(hé)唾液等體(tǐ)液中均能檢測到。具有(yǒu)運輸和(hé)轉移生(shēng)物活性分子，介導靶向細胞間(jiān)信号傳遞、遺傳信息的功能性轉移等作(zuò)用。
間(jiān)充質幹細胞（MSC）分泌大(dà)量的EV，EV內(nèi)容物包括蛋白和(hé)RNA（＞80%），以及一些(xiē)小(xiǎo)RNA，其中miRNAs約44%、tRNA約47%。MSC通(tōng)過EV與其他細胞實現信息交流，發揮治療作(zuò)用。MSC-EV可(kě)表達MSC表型标記，如CD29、CD73、CD44和(hé)CD105。
已在MSC-EV中發現850多(duō)個(gè)獨特的基因産物和(hé)160多(duō)個(gè)miRNAs。
MSC-EV已在幾種不同類型的疾病中顯示出令人(rén)鼓舞的治療效果，包括腎損傷、心髒損傷、腦(nǎo)損傷和(hé)肝肺損傷等。主要機制(zhì)可(kě)能是MSC-EV介導了MSC的旁分泌/自分泌機制(zhì)。
急慢性腎損傷方面，MSC-EV中的生(shēng)長因子mRNA可(kě)轉移到順鉑損傷的近端腎小(xiǎo)管上(shàng)皮細胞（PTEC），促進PTEC增殖；IGF-1R的mRNA通(tōng)過體(tǐ)外水(shuǐ)平轉移到腎小(xiǎo)管上(shàng)皮細胞，增強了腎小(xiǎo)管細胞對局部産生(shēng)的IGF-1的敏感性。如果骨髓MSC-EV的miRNA耗竭，則在急性腎損傷中MSC-EV的再生(shēng)修複能力顯著降低(dī)，提示在急性腎損傷恢複中，miRNAs起着關鍵作(zuò)用。
心肌梗死方面，體(tǐ)外擴增的MSC培養上(shàng)清液已成功用于縮小(xiǎo)小(xiǎo)鼠心肌梗死範圍。MSC上(shàng)清液的促再生(shēng)活性被證明(míng)為(wèi)EV組分，去除EV後則沒有(yǒu)作(zuò)用效果。MSC-EV介導的細胞保護作(zuò)用可(kě)減輕大(dà)腸杆菌內(nèi)毒素誘導的小(xiǎo)鼠急性肺損傷和(hé)低(dī)氧誘導的肺動脈高(gāo)壓。MSC-EV還(hái)展示了減輕藥物誘導肝損傷和(hé)肝纖維化的能力。
MSC-EV可(kě)直接促進血管生(shēng)成。在大(dà)鼠模型中，MSCEV可(kě)顯著改善後肢缺血灌注，加速皮膚燒傷後的再上(shàng)皮化，并提高(gāo)同種異體(tǐ)皮膚移植物的存活率。在中風模型缺血性閉塞後，MSC-EV給藥可(kě)促進功能恢複和(hé)新生(shēng)血管，顯著改善卒中誘導後的功能，但(dàn)是MSC組和(hé)MSC-EV組沒有(yǒu)明(míng)顯的療效差異。
在綿羊模型中，應用MSC-EV可(kě)觀察到大(dà)腦(nǎo)缺氧損傷的改善。miRNA-133b似乎與MSC-EV介導的大(dà)鼠缺血性卒中後的功能恢複有(yǒu)關，而miRNA-22似乎與MSC-EV介導的缺血性心髒病心肌細胞的抗凋亡作(zuò)用有(yǒu)關。
因此，MSC-EV可(kě)用于中風的治療，作(zuò)為(wèi)幹細胞輸注的替代方法，改善神經預後，增加血管與神經生(shēng)成。
MSC-EV對多(duō)種類型的免疫細胞均具有(yǒu)免疫調節作(zuò)用，包括樹(shù)突狀細胞、T細胞、B細胞和(hé)巨噬細胞。在關節炎模型中，MSC-EV體(tǐ)內(nèi)炎症抑制(zhì)作(zuò)用比MSC更強。
MSC-EV的免疫調節作(zuò)用包括：1）通(tōng)過miRNAs介導DC的免疫調節；2）通(tōng)過增強M2巨噬細胞極化和(hé)間(jiān)接驅動T細胞誘導發揮免疫抑制(zhì)作(zuò)用；3）抑制(zhì)健康供者和(hé)GvHD患者NK細胞和(hé)其他外周白細胞的激活；4）在體(tǐ)外與PBMC共培養時(shí)抑制(zhì)T細胞的激活，促進調節性CD4+、CD25+、FOXp3+、T細胞的增殖；5）高(gāo)度表達GVHD改善相關的多(duō)種可(kě)溶性因子，靜脈輸注MSC-EV可(kě)抑制(zhì)CD4+T和(hé)CD8+T細胞的活化和(hé)浸潤，從而延長GVHD小(xiǎo)鼠模型的存活時(shí)間(jiān)，并減少(shǎo)多(duō)個(gè)器(qì)官的病理(lǐ)損傷。
在小(xiǎo)鼠體(tǐ)內(nèi)的生(shēng)物發光和(hé)熒光介導的斷層成像顯示，EV靜脈注射主要分布在脾、肝、肺和(hé)腎，30分鍾內(nèi)在腦(nǎo)、心髒和(hé)肌肉中可(kě)檢測到EV，60分鍾後尿液中可(kě)檢測到EV。
已經觀察到，MSC-EV的促腫瘤和(hé)抗腫瘤作(zuò)用，目前尚無給藥的任何副作(zuò)用報道(dào)，可(kě)以認為(wèi)MSC-EV給藥基本上(shàng)安全，且由于EV不能自我複制(zhì)，無內(nèi)源性腫瘤形成潛力。
2011年，進行(xíng)了第一次有(yǒu)記錄的臨床MSC-EV給藥，MSC-EV以遞增的劑量應用于1例類固醇耐藥的GVHD患者，4×107個(gè)MSC培養上(shàng)清液分離的MSC-EV（1.3-3.5×10*10個(gè)顆粒或0.5～1.6mg）被定義為(wèi)1個(gè)單位，每隔2~3天靜脈注射一次，共2周，總共接受4個(gè)單位，GVHD症狀顯著下降，每日類固醇劑量可(kě)從125mg減少(shǎo)到30mg，治療後穩定了5個(gè)月，MSC-EV給藥耐受性良好，未觀察到副作(zuò)用。
對20例慢性腎髒病患者進行(xíng)的Ⅱ/Ⅲ期臨床研究表明(míng)，臍帶MSC-EV（輸注2次，相隔1周）可(kě)改善腎小(xiǎo)球濾過率、血肌酐水(shuǐ)平、血尿素和(hé)尿白蛋白肌酐比值，伴随着TGF-β1、IL-10水(shuǐ)平明(míng)顯升高(gāo)和(hé)血漿TNF-α水(shuǐ)平顯著下降，沒任何副作(zuò)用。
MSC-EV用于8例患者牙槽骨再生(shēng)研究發現，無不良反應，放射學評估顯示所有(yǒu)病例均有(yǒu)早期骨形成，注射部位的炎性淋巴細胞浸潤很(hěn)少(shǎo)，研究證明(míng)MSC-EV在骨再生(shēng)方面具有(yǒu)較大(dà)的潛力。
對7例長期存在大(dà)型特發性難治性黃斑裂孔患者，年齡51～75歲，行(xíng)玻璃體(tǐ)切除、內(nèi)界膜剝離、MSC（2例）或MSC-EV（5例）玻璃體(tǐ)腔內(nèi)注射；5例MH閉合術(shù)患者最佳矯正視(shì)力提高(gāo)，其中1例接受MSC治療的患者在視(shì)網膜表面觀察到纖維膜，1例接受較大(dà)劑量MSC-EV的患者出現炎症反應。
MSC-EV具有(yǒu)免疫調節活性并促進再生(shēng)過程，其方式顯然與MSC相當。因此，基于EV的無細胞療法，為(wèi)多(duō)種疾病提供了一種基于幹細胞治療的有(yǒu)前途的替代方案。與細胞療法相比，EV療法具有(yǒu)一些(xiē)優勢，但(dàn)由于該領域的新穎性，其臨床分級生(shēng)産、質量保證和(hé)應用缺乏國際公認的指南。
改變MSC的培養環境，用不同的外界刺激預處理(lǐ)，這不僅可(kě)以影(yǐng)響EV的産量，還(hái)可(kě)以調節它們的成分。例如，中風患者血清培養或缺血腦(nǎo)組織提取液處理(lǐ)，都可(kě)激活MSC釋放更多(duō)的EV。MSC培養時(shí)給予炎症刺激，将增強抗炎特性的EV釋放。
與傳統的2D培養相比，微載體(tǐ)3D培養中，MSC分泌更高(gāo)的EV，并降低(dī)整合素的表達。3D培養在MSC-EV生(shēng)産中可(kě)能優勢，包括：1）需要大(dà)量的培養基才能獲得(de)大(dà)量臨床使用的EV；2）持續的培養基灌流，可(kě)避免代謝副産物的積累；3）控制(zhì)進出生(shēng)物反應器(qì)的培養基流量可(kě)連續産出。
超速離心是收集EV最常用、最常規的方法。市面上(shàng)可(kě)買到一種快速、簡單的試劑盒，其分離方法相對粗糙、易引起可(kě)溶性蛋白污染。
超速離心方法可(kě)獲得(de)純EV用于科研，但(dàn)在臨床上(shàng)耗時(shí)長，不适合大(dà)規模生(shēng)産。超速離心聚集囊泡，易于分離到可(kě)溶性因子和(hé)蛋白質。基于密度梯度的分離EV，效率最高(gāo)。一些(xiē)新興的技(jì)術(shù)，如尺寸排除色譜、聲學分離、納米捕捉器(qì)、流場(chǎng)流動分級，都有(yǒu)可(kě)能從不同的樣品基質中分離出EV。
EV的質量保證是後續治療的基礎。雖然有(yǒu)研究表明(míng)，MSC-EV發揮了治療作(zuò)用，且無副作(zuò)用，但(dàn)必須建立适當的質量控制(zhì)标準，以确保所産生(shēng)的EV産品的質量、安全性和(hé)有(yǒu)效性得(de)到保障。如EV應儲存在等滲緩沖液中，以防止儲存和(hé)凍融循環期間(jiān)的pH變化。
幹細胞外泌體(tǐ)的深入研究有(yǒu)助于闡述幹細胞治療的精準機制(zhì)，而且幹細胞外泌體(tǐ)有(yǒu)可(kě)能在治療應用領域替代幹細胞。幹細胞外泌體(tǐ)（特指MSC-EV）是一個(gè)研究和(hé)應用都值得(de)期待的好方向，但(dàn)是需要腳踏實地地去做(zuò)些(xiē)工作(zuò)。
因此，為(wèi)了開(kāi)發基于EV的藥物，至少(shǎo)需要在以下方面産生(shēng)突破：1）适用于大(dà)規模制(zhì)備、純化和(hé)儲存的分離方案；2）量化、分子和(hé)物理(lǐ)表征的标準化方案；3）明(míng)确的臨床使用質量控制(zhì)标準。
本文來(lái)源于《醫(yī)學參考報》幹細胞與再生(shēng)醫(yī)學頻道(dào)2020-04期第4版文章