貝賽爾特學習園地|陳朝熙:支原體(tǐ)檢測

支原體(tǐ)檢測

支原體(tǐ)(mycoplasma)屬于細菌域原核生(shēng)物界硬壁菌門(mén)中低(dī) c、G含量的革蘭陽性杆菌分支柔膜體(tǐ)綱(Mollicutes)，是一類缺乏細胞壁的原核細胞型微生(shēng)物 ，大(dà)小(xiǎo)介于細菌與病毒之間(jiān)，呈高(gāo)度多(duō)形性，有(yǒu)球形、杆形、絲狀、分枝狀等多(duō)種形态。在細胞培養過程中，支原體(tǐ)感染發生(shēng)率達30％～60％，随着細胞培養技(jì)術(shù)的廣泛應用，組織、細胞、疫苗等受支原體(tǐ)污染的現象越來(lái)越普遍。

污染細胞最常見的支原體(tǐ)包括：發醉支原體(tǐ)（M.fementans）、豬鼻支原體(tǐ)（M.hyorhinis）、口腔支原體(tǐ)（ M.orale ）、精氨酸支原體(tǐ)（ M.arginina ）、梨支原體(tǐ)（M.pirum）、唾液支原體(tǐ)（M.salivarium）和(hé)人(rén)型支原體(tǐ)（M.hominis）。被這些(xiē)支原體(tǐ)污染的細胞常常不引起明(míng)顯的細胞病變，也不導緻培養液渾濁，難以憑肉眼發現，因此，建立一種高(gāo)效、快速、敏感度高(gāo)的檢測方法十分必要。

支原體(tǐ)的檢測方法有(yǒu)很(hěn)多(duō)種，《中國藥典》中支原體(tǐ)檢測方法包括培養法、DNA熒光染色法，其他方法還(hái)有(yǒu)酶法、PCR法、ELISA法、間(jiān)接免疫熒光試驗、生(shēng)化檢測法、直接血凝試驗、探針法、放射自顯影(yǐng)法等。每種方法各有(yǒu)利弊，不同方法的支原體(tǐ)檢出率也有(yǒu)差别，一般在5％ ～87％之間(jiān)。本次講述培養法、DNA熒光染色法、PCR法檢測。

1、培養法

方法：配制(zhì)支原體(tǐ)培養基，取1 mL細胞培養液，接種于液體(tǐ)培養基中，37 ℃培養，同時(shí)觀察是否有(yǒu)混濁或pH值改變。2周後，分别取0.1 mL液體(tǐ)培養液塗在瓊脂平闆上(shàng)，倒置于37 ℃厭氧箱培養，至少(shǎo)3周，持續觀察是否有(yǒu)支原體(tǐ)菌落出現，有(yǒu)圓形無色透明(míng)菌落出現為(wèi)陽性。

評價：此法是較早采用的方法。在固體(tǐ)瓊脂培養基、半固體(tǐ)或液體(tǐ)培養基上(shàng)培養 Vero、NIH3T3 等易被支原體(tǐ)污染的細胞株，可(kě)在其中分離到支原體(tǐ)菌株。培養法得(de)到支原體(tǐ)菌株是最可(kě)靠的陽性指标。該方法的缺點是靈敏度低(dī)，不能檢測到種屬且不适用于檢測所有(yǒu)支原體(tǐ)。

2、DNA熒光染色法

方法：

①制(zhì)備标本。首先，在六孔闆中制(zhì)備蓋玻片細胞培養物，然後将待測細胞接種到蓋玻片上(shàng)，用培養液培養 1 ～ 2 d。采用有(yǒu)支原體(tǐ)污染的細胞作(zuò)陽性對照，無支原體(tǐ)污染的細胞作(zuò)陰性對照。

②固定。首先，吸出培養液，用新鮮配制(zhì)的 1∶3冰醋酸 /甲醇固定液固定 15 min；然後，吸出固定液後重複固定一次；最後，吸除固定液室溫下幹燥。

③染色。用 pH值 7.2的 PBS稀釋Hoechst33258儲存液，使終濃度為(wèi) 5μg/ml；然後将染液滴加到固定好的細胞上(shàng)，室溫下避光染色 30 min。

④洗滌。用雙蒸水(shuǐ)浸泡染色過的蓋玻片 3次，每次 3 ～ 5 min。⑤封片。滴加 1滴含 50%甘油的檸檬酸緩沖液( pH值 5.5)到染色過的細胞表面，然後将蓋玻片上(shàng)有(yǒu)細胞的一面朝下，覆蓋在載玻片上(shàng)。⑥觀察。在熒光顯微鏡下觀察細胞的熒光分布狀态，判斷有(yǒu)無支原體(tǐ)污染及污染程度。

評價：利用熒光燃料 Hoechst33258 能與DNA 特異性結合的性質，在熒光顯微鏡下觀察被支原體(tǐ)污染的細胞時(shí)，除細胞核外，在細胞膜上(shàng)及細胞之間(jiān)也有(yǒu)熒光顆粒。熒光染色法分為(wèi)直接法和(hé)間(jiān)接法兩類，直接法即用染色劑将待測細胞直接染色；間(jiān)接法指在無污染指示細胞中加入待測細胞上(shàng)清液，進行(xíng)混合培養後再染色，因此間(jiān)接法的靈敏度高(gāo)于直接法。

3、PCR法

方法：采用酚氯法提取待測細胞DNA，引物為(wèi)常見污染支原體(tǐ)種類16sRNA的保守區(qū)域序列，長度472 bp，引物A：5’-GGCGAATGGGTGAGTAACACG-3’，引物B：5’-CGGATAACGCTTGCGACCTATG-3’。PCR總反應體(tǐ)積為(wèi)25 μL，加入PCR緩沖液、氯化鎂、Taq酶、dNTP、模闆和(hé)引物。擴增條件為(wèi)：94 ℃預變性3 min，94 ℃變性25 s，58 ℃退火(huǒ)45 s，72 ℃延伸45 s， 循環30次後，72 ℃恒溫7 min。取9 μl擴增産物與1 μl 10×Loading Buffer混合後，加入含0.5 μg/ml溴化乙錠的1.5％瓊脂糖凝膠，75V電(diàn)泳25 min，用紫外檢測儀觀察并用凝膠成像系統照相，有(yǒu)目的片段出現為(wèi)陽性。

評價：PCR 法是目前常用的支原體(tǐ)污染檢測方法，其原理(lǐ)是根據具有(yǒu)支原體(tǐ)種或屬特征的核酸序列（一般用 16S rRNA）設計(jì)引物，經預變性、擴增、延伸後得(de)到擴增産物，進行(xíng)瓊脂糖凝膠電(diàn)泳實驗後，通(tōng)過凝膠上(shàng)條帶的位置進行(xíng)判斷待測物是否感染了支原體(tǐ)。PCR 法靈敏度高(gāo)，檢測時(shí)間(jiān)短(duǎn)，操作(zuò)簡便，但(dàn)仍然存在一定缺陷：如易出現假陽性或假陰性等。近年來(lái)出現了兩步法 PCR 檢測支原體(tǐ)污染的方法，即在第一次 PCR 的基礎上(shàng)，再進行(xíng)第二次 PCR。其原理(lǐ)與 PCR 理(lǐ)相同，隻是分别采用外引物 (outer p rimer) 和(hé)內(nèi)引物 (inner primer) 分兩輪進行(xíng)擴增，相對于傳統 PCR 法而言，其準确性、特異性和(hé)靈敏度均有(yǒu)所提高(gāo)。

細胞制(zhì)劑質控标準檢測項目至少(shǎo)包括內(nèi)毒素檢測、無菌檢測、支原體(tǐ)檢測、細胞數(shù)量、細胞存活率、細胞表型等的檢測。支原體(tǐ)檢測在質檢中也具有(yǒu)很(hěn)重要的地位。支原體(tǐ)感染細胞後一般難于清除，事實上(shàng)，被支原體(tǐ)污染的細胞，即使污染被清除，細胞原有(yǒu)的生(shēng)物學特性，如基因的表達、抗原性和(hé)代謝特點也随之發生(shēng)了相應的改變，會(huì)對研究結果造成嚴重影(yǐng)響。為(wèi)了保證細胞體(tǐ)系免受污染的影(yǐng)響，關鍵是加強預防盡可(kě)能減少(shǎo)污染的發生(shēng)，一般需要在培養液中加入抗生(shēng)素；另外，清潔的實驗室環境和(hé)良好的操作(zuò)習慣，優質的試劑，如血清、培養基等都是很(hěn)重要的。