近日， 美國血液學學會(huì)（ASH）會(huì)議公布了一份最新的研究成果摘要，賓夕法尼亞大(dà)學Dr. Milone研究團隊，宣布其可(kě)在短(duǎn)短(duǎn)24小(xiǎo)時(shí)內(nèi)産生(shēng)功能性CD19特異性CAR-T細胞（CART19），此方法是5天、3天CAR-T制(zhì)備技(jì)術(shù)上(shàng)的又一更新。該研究團隊将于12月9日在ASH會(huì)議上(shàng)公布更多(duō)的數(shù)據。
（ 圖片來(lái)源：ash.confex）
該研究的通(tōng)信作(zuò)者Dr. Michael Milone是賓夕法尼亞大(dà)學醫(yī)院和(hé)醫(yī)學院的病理(lǐ)學和(hé)檢驗醫(yī)學副教授。他于1999年從新澤西州的醫(yī)學和(hé)牙科大(dà)學獲得(de)醫(yī)學博士學位；在賓夕法尼亞大(dà)學繼續接受內(nèi)科，實驗室醫(yī)學和(hé)輸血醫(yī)學的研究生(shēng)醫(yī)學培訓；在博士後研究期間(jiān)繼續科學研究；是賓大(dà)的Carl June博士CAR-T項目的早起原研人(rén)員，這項工作(zuò)導緻了對B細胞白血病和(hé)淋巴瘤患者的人(rén)工抗原受體(tǐ)的開(kāi)放式I期研究。
（圖片來(lái)源：med.upenn.edu）
Michael Milone, MD, PhD
Associate Professor of Pathology and Laboratory Medicine
14年前，Dr. Milone與貝賽爾特董事長兼首席科學家(jiā)許中偉教授是Carl June團隊CAR-T項目最早的原研人(rén)員，他們研發的CTL-019最終成為(wèi)了人(rén)類第一個(gè)被FDA批準的CAR-T藥物。許教授在參加“細胞治療國際研討(tǎo)會(huì)上(shàng)”提道(dào)：“未來(lái)，CAR-T細胞制(zhì)備的工藝極其重要。随着細胞制(zhì)備的周期不斷縮短(duǎn)，“24小(xiǎo)時(shí)CAR”、甚至“vein-to-vein”CAR-T的産生(shēng)，除了極大(dà)地降低(dī)了綜合成本，也将颠覆現有(yǒu)的生(shēng)産模式和(hé)概念。”這對于病情進展迅速的患者來(lái)說是至關重要的。
許中偉教授在“2019（第十屆）細胞治療國際研討(tǎo)會(huì)”上(shàng)提出CAR-T生(shēng)産“vein-to-vein”模式和(hé)概念。
許中偉教授與Michael Milone在北京大(dà)學未名湖(hú)畔合影(yǐng)。
許教授回國後，引薦Dr. Michael Milone成為(wèi)“北京大(dà)學免疫系客座教授”兼“貝賽爾特公司特約顧問”，共同為(wèi)細胞免疫治療行(xíng)業助力
CAR-T細胞制(zhì)造過程的流程圖（圖片來(lái)源：discovery.ucl.ac.uk）
在目前的細胞治療開(kāi)發過程中，盡管CAR-T細胞的生(shēng)産通(tōng)過各種制(zhì)造方法進行(xíng)，但(dàn)所有(yǒu)制(zhì)造方法都包括相同的共同步驟。
首先，通(tōng)過白細胞分離術(shù)分離患者的白細胞（WBC）并洗滌。然後，激活T細胞，用CAR轉基因轉導，擴增至所需的細胞數(shù)量用于治療，制(zhì)劑生(shēng)産和(hé)灌裝。在對患者進行(xíng)質量控制(zhì)測試和(hé)預備性淋巴清除化學療法後，将産品注射到患者體(tǐ)內(nèi)。
（圖片來(lái)源：discovery.ucl.ac.uk）
白細胞分離術(shù)和(hé)細胞洗滌 T細胞療法開(kāi)始于通(tōng)過白細胞分離法獲得(de)患者的WBC，這是一種将白細胞與全血分離的單采血液成分術(shù)。通(tōng)常采用連續或者半連續的密度梯度離心方法。在分離過程中添加的抗凝劑，紅細胞和(hé)血小(xiǎo)闆在洗滌過程中會(huì)被清除。抗凝劑在活化的過程中能夠改變細胞的特征，紅細胞會(huì)影(yǐng)響産品的臨床效果，血小(xiǎo)闆會(huì)導緻細胞的聚集。洗滌後，直接使用WBCs或者WBCs經程序降溫冷凍保存。
富集和(hé)細胞 一些(xiē)研究人(rén)員使用CliniMACS系統對細胞進行(xíng)富集和(hé)洗滌，其中相應的抗體(tǐ)與順磁珠連接。FredHutchinson Cancer研究中心和(hé)西雅圖兒童醫(yī)院為(wèi)CD4＋（輔助性T細胞）和(hé)CD8+細胞（細胞毒T細胞）富集WBC，以便輸入具有(yǒu)确定的CD8+/CD4+細胞比例的産品。類似的，Brown等富集收集CD62L+細胞。MDAnderson癌症中心發現NK細胞會(huì)阻礙T細胞的培養。當NK細胞超過10%時(shí)，使用CD56+磁珠可(kě)以去除NK細胞。拉莫斯等人(rén)在具有(yǒu)> 95％循環白血病細胞的兩名患者中進行(xíng)CD3 +選擇，以使得(de)能夠從含有(yǒu)低(dī)百分比的T細胞的單采血液成分産物中擴增。
活化 在體(tǐ)內(nèi)，通(tōng)過抗原呈遞細胞，例如樹(shù)突細胞（DC）刺激天然T細胞的增殖和(hé)分化。T細胞通(tōng)過T細胞受體(tǐ)（TCR）與位于DC細胞表面的主要組織相容性複合物之間(jiān)的相互作(zuò)用以及通(tōng)過共刺激分子（如CD28，4-1BB和(hé)OX40）激活。為(wèi)了避免與DC共培養繁瑣的過程，已經開(kāi)發并實施了幾種模拟T細胞天然刺激的方法。最基本的方法是加入OKT3（抗CD3單克隆抗體(tǐ)）和(hé)白細胞介素。
基因遞送 基因遞送可(kě)以分為(wèi)病毒和(hé)非病毒的方法。在CAR-T細胞治療中，包括電(diàn)轉DNA，轉座子系統以及病毒載體(tǐ)，尤其是慢病毒或逆轉錄病毒轉染。病毒轉導是最常見的基因遞送方法。
擴增 在目前的細胞培養過程中，通(tōng)常增加培養基體(tǐ)積；通(tōng)常通(tōng)過增加袋子或燒瓶的尺寸或通(tōng)過從闆到燒瓶，燒瓶到靜态培養袋或靜态培養袋換成RM生(shēng)物反應器(qì)。
目前，在所有(yǒu)CAR-T研究機構中，賓夕法尼亞大(dà)學接受了大(dà)多(duō)數(shù)的患者；細胞的靶點通(tōng)常是CD19 ，起源産品主要是自體(tǐ)T細胞；大(dà)多(duō)數(shù)CAR-T細胞産品的制(zhì)造時(shí)間(jiān)在14天；CAR-T細胞療法主要用于治療血液系統惡性腫瘤。
圖表分析（ 圖片來(lái)源：discovery.ucl.ac.uk）
CAR-T細胞療法的療效取決于過繼轉移後T細胞的植入和(hé)持久性。植入和(hé)持久性的潛力與T細胞分化的狀态有(yǒu)關，賓大(dà)團隊此前已經證明(míng)減少(shǎo)離體(tǐ)培養的持續時(shí)間(jiān)将限制(zhì)T細胞分化并提高(gāo)CAR-T細胞療法的療效。但(dàn)是大(dà)多(duō)數(shù)實驗方案通(tōng)常先通(tōng)過TCR和(hé)共刺激受體(tǐ)的結合激活T細胞，然後将T細胞離體(tǐ)擴增9到14天，這對于CAR-T細胞療法的療效産生(shēng)了一定的影(yǐng)響。
于近期發表在ASH年會(huì)上(shàng)的研究摘要，賓大(dà)團隊描述了使用慢病毒載體(tǐ)可(kě)在一天內(nèi)産生(shēng)功能性CD19特異性CAR-T細胞（CART19），而無需事先激活T細胞。該摘要顯示了使用非優化過程，可(kě)以使用表達紅外紅色熒光蛋白（iRFP）的慢病毒載體(tǐ)轉導平均6.5％（範圍為(wèi)2％-10％）的新鮮分離的靜态T細胞，與活化的T細胞轉導相比，表達動力學更慢（靜态和(hé)活化T細胞分别在96小(xiǎo)時(shí)和(hé)48小(xiǎo)時(shí)達到峰值）。盡管與活化的T細胞相比效率低(dī)得(de)多(duō)，但(dàn)在所有(yǒu)T細胞亞群中檢測，其中央記憶T細胞顯示出最大(dà)的轉導效率；與未處理(lǐ)的T細胞相比，平均轉導率高(gāo)4倍。
賓大(dà)團隊證明(míng)了即使沒有(yǒu)逆轉錄或整合酶功能，CAR表達也可(kě)以在靜态的T細胞中發生(shēng)，即所謂的“僞轉導”。重要的是，賓大(dà)團隊證明(míng)了該表達産生(shēng)的CAR-T細胞具有(yǒu)溶細胞活性和(hé)效應細胞因子，對抗原的反應類似于激活和(hé)轉導的CAR-T細胞。
（ 圖片來(lái)源：ash.confex）
該研究團隊使用公認的急性淋巴母細胞白血病Nalm6模型進行(xíng)試驗，發現由靜态T細胞轉導16小(xiǎo)時(shí)後洗滌去除載體(tǐ)産生(shēng)的CART19細胞表現出劑量依賴性的抗白血病活性，該活性隻要注射小(xiǎo)劑量即可(kě)持久2x10^5個(gè)T細胞。
利用慢病毒載體(tǐ)将基因轉移到靜态T細胞的能力，描述的高(gāo)度簡化的制(zhì)造方法具有(yǒu)增強治療效力的潛力，同時(shí)還(hái)大(dà)大(dà)降低(dī)了成本。此外，這種制(zhì)造方法還(hái)可(kě)能擴大(dà)接受療法的患者數(shù)量。
文章來(lái)源：
1.https://ash.confex.com/ash/2019/webprogram/Paper131147.html static/file/ASCO2019_Poster_C-145-04_cervical_FINAL 3.https://www.med.upenn.edu/cci/milonelab/
